변성 단계
이 단계에서 주형 DNA와 기타 모든 핵심 성분을 포함하는 칵테일은 94-95⁰C로 가열됩니다.
온도가 높으면 수소결합이 생기고?두 가닥의 주형 DNA 염기 사이를 절단하여 분리하고 두 가닥을 분리합니다.
그 결과 두 개의 단일 DNA 가닥이 생성되고, 이는 새로운 DNA 가닥 생산을 위한 주형 역할을 합니다.
DNA 가닥이 완전히 분리되도록 이 단계에서 온도를 충분히 오랫동안 유지하는 것이 중요합니다.
이 작업은 일반적으로 15-30초 정도 걸립니다.
어닐링 단계
이 단계 동안 반응은 50-65⁰C로 냉각됩니다. 이를 통해 프라이머는 수소 결합을 통해 단일 가닥 주형 DNA의 특정 위치에 부착될 수 있습니다(정확한 온도는 사용하는 프라이머의 녹는 온도에 따라 다름).
프라이머는 DNA 또는 RNA의 단일 가닥입니다.?길이가 약 20~30개 염기인 서열입니다.
프라이머는 상호보완적으로 설계되었습니다.?복사할 서열의 각 끝 부분에 있는 DNA의 짧은 부분을 순서대로 복사합니다.
프라이머는 DNA 합성의 출발점 역할을 합니다. 중합효소는 DNA의 이중 가닥에만 DNA 염기를 추가할 수 있습니다. 프라이머가 결합된 후에만 중합효소 효소가 부착되어 느슨한 DNA 염기로부터 새로운 상보적인 DNA 가닥을 만들기 시작할 수 있습니다.
두 개의 분리된 DNA 가닥은 상보적이며 반대 방향(한쪽 끝 – 5' 끝 – 다른 쪽 끝 – 3' 끝)으로 진행됩니다. 결과적으로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 두 가지 프라이머가 있습니다.
이 단계는 일반적으로 약 10-30초 정도 소요됩니다.
확장 단계
이 마지막 단계에서 DNA 염기를 추가하는 특수 Taq DNA 중합효소에 의해 새로운 DNA가 생성될 수 있도록 열이 72⁰C로 증가됩니다.
Taq DNA 중합효소는 열을 좋아하는 박테리아에서 채취한 효소입니다.? 테르무스 아쿠아티쿠스.
이 박테리아는 일반적으로 온천에 서식하므로 80⁰C 이상의 온도에도 견딜 수 있습니다.
박테리아의 DNA 중합효소는 고온에서 매우 안정적입니다. 이는 PCR의 변성 단계에서 DNA 가닥을 분리하는 데 필요한 온도를 견딜 수 있음을 의미합니다.
대부분의 다른 유기체의 DNA 중합효소는 이러한 고온을 견딜 수 없습니다. 예를 들어 인간 중합효소는 37˚C(체온)에서 이상적으로 작동합니다.
72⁰C는 Taq 중합효소가 상보 가닥을 만드는 최적의 온도입니다. 프라이머에 부착한 후 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥에 DNA 염기를 하나씩 추가합니다.
그 결과 새로운 DNA 가닥과 이중 가닥 DNA 분자가 탄생합니다.
이 단계의 기간은 증폭되는 DNA 서열의 길이에 따라 다르지만 일반적으로 1,000 DNA 염기(1Kb)를 복사하는 데 약 1분 정도 소요됩니다.
이러한 세 가지 열 순환 과정은 20-40번 반복되어 관심 있는 DNA 서열의 사본을 많이 생성합니다.
PCR 중에 생성된 새로운 DNA 조각은 DNA 중합효소가 부착되어 DNA 생성을 시작할 수 있는 주형 역할도 합니다.
그 결과 상대적으로 짧은 시간 내에 특정 DNA 세그먼트의 엄청난 수의 복사본이 생성됩니다.